Vacinas de DNA

A descoberta da vacina foi um momento revolucionário na medicina...Graças a ela, muitas das epidemias e pestes foram evitadas e outras travadas... A  vacina é uma substância produzida a partir de diversos agentes estranhos como proteínas,  toxinas, bactérias ou vírus (ou partes deles) mortos ou enfraquecidos (agentes patogénicos) que causam doenças. Ao ser introduzida no corpo do ser humano, a vacina provoca uma reacção do sistema imunitário, semelhante à que ocorreria no caso de uma infecção por um determinado agente patogénico, promovendo a produção de anticorpos (leucócitos). Estes, por sua vez irão combater o agente infecciosos acabando assim por tornar o organismo imune ou, ao menos mais resistente, a esse agente (e às doenças por ele provocadas). Desta forma, a vacina prepara o organismo para que, em caso de infecção por aquele agente patogénico, o sistema de defesa possa agir de forma rápida e eficaz. Assim, a doença não se desenvolve ou, em alguns casos, se desenvolve de forma moderada.  

Dentro das vacinas temos um grupo às quais denominamos Vacinas de DNA, que requerem a técnica de DNA recombinante para a sua produção. 

 Como são feitas???

•  Seleccionam-se e isolam-se sequências do material genético do agente patogénico que codificam antigénios (componentes moleculares estranhos que estimulam uma resposta imunitária específica).
• Através da acção de uma determinada enzima de restrição, o DNA do agente infeccioso é fragmentado, obtendo-se assim as sequências do material genético seleccionadas.
• As sequências resultantes da fragmentação são inseridas no DNA de vetores (plasmídeos ou vetores virais que foram submetidos à acção da mesma enzima de restrição que o agente infeccioso) com o auxilio das ligases, dando origem ao DNA recombinante. Como resultado temos  um plasmídeo, ou um outro vetor, com a porção do DNA do agente infecciosos com interesse.
• Este plasmídeo é inserido, normalmente  na bactéria Escherichia coli. Esta bactéria ao se reproduzir, permite que o plasmídeo se reproduza em larga escala, o que é fundamental para a produção da vacina. 
• O vetor deve possuir gene de resistência a antibiótico (que permite seleccionar as bactérias que contêm o plasmídeo). Também podem ser inseridos outros genes para além daqueles que codificam o antigénio, com o objectivo de melhorar a eficácia da vacina.
• Os genes retirados do agente patogénico codificam proteínas, que se produzem quando estes genes se expressam.

Quando estas vacinas são administradas a seres humanos, o DNA inserido é reconhecido pelas suas células, que começam a produzir proteínas, que seriam normalmente produzidas por bactérias, vírus ou outro agente patológico. Deste modo, o organismo humano (hospedeiro) reconhece estas proteínas e produz uma imunidade contra estas substâncias, criando-se assim uma memória imunológica.

Ao compararmos as vacinas tradicionais às vacinas de DNA, estas últimas apresentam algumas vantagens e desvantagens relativamente às outras. Por um lado, são mais vantajosas economicamente e tecnicamente , uma vez que possuem um controle de qualidade mais simples, não precisam de refrigeração para o seu transporte (estáveis em temperatura ambiente), têm um baixo custo de produção e manutenção, estimula a produção de linfócitos T, responsáveis por identificar e matar as células infectadas, etc. Por outro lado, tem as suas desvantagens, tais como: dificuldade em reconhecer, seleccionar e correlacionar todas as partes do DNA do agente que se quer combater; possibilidade da indução de uma doença auto imune...

As vacinas de DNA podem ser administradas por diferentes vias, sendo a injecção intra muscular a forma mais utilizada.

Texto elaborado a partir de:

• http://www.sbac.org.br/pt/pdfs/rbac/rbac_40_03/05.pdf
• http://www.brasilescola.com/biologia/as-vacinas-de-dna.htm
• http://pt.wikipedia.org/wiki/Vacina
• http://www.icb.ufmg.br/big/vacinas/Vacinas%20de%20DNA.htm
• http://www.ebah.com.br/content/ABAAAe-W4AK/vacinas-dna

                                                                                                                                  Cristina Sterbet

Sexagens - Uma aplicação da técnica de PCR

Como estudámos recentemente, a técnica de PCR é utilizada para a amplificação de determinadas porções de ADN. Provavelmente ainda não pararam para pensar: “Por que razão será útil clonar determinadas porções de ADN?” Pois bem, hoje apresento-vos uma das utilidades do PCR.

Recentemente tive a oportunidade de ‘trabalhar’ num laboratório da Universidade de Cardiff, País de Gales. Durante duas semanas estive a fazer ‘Sexagens’. E o que é isto? É nada mais nada menos que a determinação do género de determinados indivíduos. Neste caso efetuou-se a sexagem em indivíduos de duas espécies de aves marinhas: Pterodroma deserta (Freira do Bugio) e Puffinus baroli (Frulho). Estas duas espécies apresentam um baixo grau de dimorfismo sexual, ou seja, é difícil diferenciar o macho da fêmea em termos morfológicos. Quando se pretende estudar estas espécies (trajetos de migração, lugares de nidificação, alimentação, …) é importante possuir dados estatísticos relativamente ao género dos indivíduos. A técnica de PCR permite identificar geneticamente as ‘diferenças’ que não são visíveis a olho nu.

No ser humano (e outros seres vivos) é o espermatozoide que define o género dos descendentes podendo transportar um cromossoma sexual X ou Y. Ao juntar-se ao oócito II (sempre com o cromossoma sexual X) origina machos (XY) ou fêmeas (XX). No entanto, as aves (e alguns outros seres vivos) possuem outro sistema de determinação do sexo, ZW. Nas aves é o gâmeta feminino que determina o sexo das crias pois transporta um de dois cromossomas sexuais: Z ou W. As fêmeas são consideradas heterogaméticas (ZW) e os machos homogaméticos (ZZ).

 O gene CHD1 (que codifica uma enzima e existe em ambos os cromossomas Z e W) é aquele que nos vai indicar qual o sexo de cada indivíduo. E como? O cromossoma Z possui o gene CHD1-Z que difere do gene CHD1-W (presente no cromossoma W) porque, como tem diferentes intrões, apresenta um maior número de bases (tem maior tamanho). Assim, os machos possuem dois genes CHD1-Z e as fêmeas um gene CHD1-Z e um CHD1-W.

Metodologia utilizada:

∙          As extrações de ADN são feitas a partir de uma amostra de sangue do indivíduo em estudo. Os tubos com o sangue são colocados numa centrifugadora durante 3 minutos na velocidade máxima (para que as partículas do sangue sejam separadas do álcool 90% utilizado como conservante). Coloca-se uma parte do sangue num tubo (chamado tubo de Eppendorf) com 50ml de H₂O purificada e adicionam-se 20ml de uma resina especial.

Notas: os tubos devem estar sempre numerados para que correspondam ao indivíduo que cuja amostra está a ser analisada; é habitual ter pelo menos dois tubos sem amostra de sangue que servirão como negativos para assegurar que não há nenhuma contaminação.

∙          As preparações são colocadas num Vortex para misturar tudo e posteriormente numa pequena centrifugadora a baixa velocidade por cerca de 3 segundos para garantir que toda a amostra se encontre no fundo do tubo, ou seja, que nenhuma gota fica colada às paredes do tubo. Posteriormente colocam-se os tubos numa placa de aquecimento a 50°C durante 30 minutos, seguidos de 8 minutos a 100°C.

∙          Prepara-se num pequeno tubo uma solução com uma mistura pré-feita (que inclui os nucleótidos do ADN (dNTP’s) e a Taq-polimerase, entre outros componentes), H₂O purificada, os primers (forward e reverse) e BSA (uma proteína chamada Albumina de Soro de Bovino que é um antioxidante e controla o pH). Nota: As quantidades de cada um dos ‘ingredientes’ variam consoante a quantidade de amostras que vão ser analisadas no PCR.

Nota: Primers utilizados:

2550F: 5´-GTTACTGATTCGTCTACGAGA-3´

2718R: 5´-ATTGAAATGATCCAGTGCTTG-3´

∙          Divide-se a solução por cada um dos tubos do PCR. Adiciona-se aos tubos do PCR uma parte da amostra de sangue (apenas cerca de 1ml da parte superficial do líquido da amostra preparada inicialmente).

∙          Os tubos são então colocados num termociclador que é programado de acordo com as instruções do fabricante e consoante o tipo de amostras. Há um primeiro ciclo para aquecimento seguido de vários ciclos alternando aquecimento e arrefecimento e terminando com uma última fase de arrefecimento.

O que ocorre durante o PCR?

Inicialmente (devido ao aumento de temperatura) quebram-se as ligações por pontes de hidrogénio existentes entre os nucleótidos. As duas cadeias de ADN ficam então ‘livres’ e os primers vão-se ligar em zonas específicas (com sequências de nucleótidos complementares às suas) de cada uma das cadeias de ADN. A Taq-polimerase é uma enzima que ao encontrar os primers reconhece-os como locais de início de síntese. Assim, facilita a construção de uma cadeia de ADN (complementar à existente) utilizando os nucleótidos disponíveis. Este processo repete-se durante os ciclos do PCR. Isto significa que, no final do PCR, uma determinada porção do ADN (delimitada de acordo com os primers utilizados) vai existir em quantidades muito superiores em comparação com o resto do ADN. Neste caso, no final do PCR existem grandes quantidades dos genes CHD1-Z (independentemente do género do indivíduo) e CHD1-W (apenas se o indivíduo for uma fêmea).

Depois do PCR terminar é colocada uma ‘tinta’ em cada uma das amostras que vai funcionar como um corante. As amostras são posteriormente colocadas nos poços existentes no gel de agarose (notar que o primeiro poço deve ser deixado para a escala de número de bases (pois esta servirá de comparação) e deve colocar-se uma amostra de uma fêmea, previamente confirmada (o positivo), para garantir que a eletroforese é eficaz).

Nota: Como preparar o gel de agarose e a eletroforese?

∙        Seleciona-se um tabuleiro e coloca-se uma fita de cada lado para impedir que o gel escorra para o lado e colocam-se os pentes que vão fazer com que se formem poços para colocar as amostras.

∙        Mede-se a agarose numa balança e transfere-se para um balão de Erlenmeyer. Adiciona-se uma solução-tampão feita a partir de água e TBE (em partes iguais). Leva-se o balão ao micro-ondas para fundir a agarose (basta cerca de 30 segundos, até a solução ficar transparente).

∙        À solução adiciona-se Brometo de Etídio, um agente altamente cancerígeno (razão pela qual se devem usar dois pares de luvas na preparação deste gel), que se vai ligar às cadeias duplas de ADN tornando-as fluorescentes quando sob a ação de radiação ultravioleta.

∙        Coloca-se o gel no tabuleiro e espera-se cerca de 30 minutos até que solidifique. Quando o gel está solidificado (como gelatina), removem-se os pentes e coloca-se o tabuleiro no aparelho de eletroforese.

O aparelho de eletroforese possui um polo negativo (onde as amostras são colocadas) e um positivo para o qual o ADN migra, uma vez que as moléculas de ADN são carregadas negativamente. Quando se liga o aparelho (isto pode ser verificado por aparecerem pequenas bolhas de ar no lado do polo negativo), gera-se uma diferença de potencial e os fragmentos de ADN começam a percorrer o gel sendo que os mais ‘pesados’ (maior número de bases) são mais ‘lentos’ e os mais ‘leves’ (menor número de bases) são mais ‘rápidos’, percorrendo, por isso, uma maior distância no mesmo período de tempo. Neste caso os fragmentos que correspondem ao gene CHD1-Z são os mais pesados e os que correspondem ao gene CHD1-W os mais leves. Por esta razão, quando se aplica a diferença de potencial, os fragmentos do gene CHD1-W vão migrar mais rapidamente que os do gene CHD1-Z.

Para observar os resultados da eletroforese é necessário remover o gel de agarose do tabuleiro e coloca-lo sob radiação ultravioleta. A radiação ultravioleta vai tornar visíveis os fragmentos de ADN resultantes do PCR e vai ser possível observar bandas fluorescentes. Como os machos possuem dois genes CHD1-Z, nos resultados da eletroforese surge apenas uma banda (onde estão todos os fragmentos correspondentes ao gene CHD1-Z). Por outro lado, as fêmeas possuem um gene CHD1-Z e um gene CHD1-W que migram a diferentes velocidades (pois possuem diferentes tamanhos) e por isso nos resultados da eletroforese surgem duas bandas: uma banda onde se encontram os fragmentos que correspondem ao gene CHD1-Z e a outra onde se encontram os fragmentos que correspondem ao gene CHD1-W.

Notas: Normalmente os resultados indicativos de macho são repetidos. Estes resultados que apresentam uma só banda sugerem que o indivíduo possuía dois genes CHD1-Z o que pode não corresponder à verdade pois pode ter havido algum impedimento e os fragmentos correspondentes ao gene CHD1-W podem não ter conseguido migrar o suficiente para se notar a segunda banda. Quando um negativo apresenta um resultado é necessário considerar repetir a extração pois provavelmente na altura das extrações houve contaminação que levou a que parecesse que o negativo tinha uma amostra. Isto poderá querer dizer que as outras amostras também podem estar contaminadas. Quando um positivo não apresenta resultado é necessário considerar repetir a eletroforese pois terá havido algum problema e os fragmentos de gene, que deviam ter migrado, não migraram. As amostras que não apresentam um resultado claro também devem ser repetidas.

Para os apaixonados pela parte prática da ciência, é fantástico fazer sexagens! Posso confirmar por experiência própria. Este trabalho de laboratório envolve muita paciência e concentração, mas, melhor ainda, envolve muitos instrumentos que às vezes parecem existir só em filmes. Para além disso, a prática ajuda a compreender a teoria. Obviamente o PCR não é utilizado só para fazer sexagens mas é uma das suas utilidades no dia-a-dia de vários investigadores científicos, principalmente no campo da genética. Se tinham dúvidas de como o PCR podia ser útil, espero ter conseguido esclarecê-las, se não, façam favor de perguntar!

Beatriz Felgueiras

O que acontece durante um PCR:

http://www.youtube.com/watch?v=2KoLnIwoZKU

Agora para quem quiser rir-se um bocadinho:

http://www.youtube.com/watch?v=x5yPkxCLads

Trabalho elaborado por Beatriz Felgueiras a partir de pesquisa (vistos pela última vez a 12.03.2013):

http://www.plosone.org/article/info:doi/10.1371/journal.pone.0046330

http://www.biollett.amu.edu.pl/biollett_43_1_1.pdf

http://eprints.whiterose.ac.uk/364/1/burket1.pdf

http://www.e-escola.pt/topico.asp?hid=339

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22553188

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/9711866

http://rspb.royalsocietypublishing.org/content/263/1377/1635.short

http://en.wikipedia.org/wiki/ZW_sex-determination_system

http://www.cbra.org.br/pages/publicacoes/rbra/download/pag66-70.pdf

http://www.dominiopublico.gov.br/pesquisa/DetalheObraForm.do?select_action=&co_obra=135898

http://www.ufg.br/conpeex/2006/porta_arquivos/pivic/0378989-LudimilaAparecidaCavalcanteWosnjuk.pdf

A Leucemia

A leucemia sempre me intrigou. Sempre me questionei sobre onde é que a doença começa? Qual o porquê da leucemia acontecer? Será que as pessoas afectadas com esta doença ficam completamente curadas após o tratamento? Assim sendo, vou investigar sobre esta doença... A LEUCEMIA!

 

Primeiro vou começar por explicar o que é a Leucemia...

 

A leucemia é uma doença maligna (cancro) com origem nas células sanguíneas. Não é uma doença hereditária, trata-se de uma alteração genética adquirida nas células produzidas na medula óssea (tecido existente dentro dos ossos), nomeadamente nos leucócitos. É uma doença mais comum nos homens do que nas mulheres no entanto as causas deste facto ainda são desconhecidas.

 

Num individuo normal (sem esta doença) as células normais (hemácias, leucócitos e plaquetas) produzidas na medula óssea dividem-se, diferenciam-se e morrem. Quando umas morrem outras nascem - ciclo celular. Assim sendo, o número de leucócitos produzidos "igualam" o número de leucócitos que vão morrendo, existindo sempre o mesmo número de leucócitos necessários ao organismo.

 

A leucemia deriva de uma alteração no controlo da divisão, no crescimento e na diferenciação celular. E o que é que acontece num individuo afectado? Num individuo afectado (com esta doença) a medula óssea produz mais leucócitos do que devia, estando a produção deste descontrolada. Assim a medula óssea não irá produzir suficientemente as outras células sanguíneas necessárias ao nosso organismo (hemácias e plaquetas), então o organismo começa a enfraquecer levando ao aparecimento de anemia.

 

  Existem vários tipos de leucemia:

  - LMA - Leucemia Mielóide Aguda (mais comum nos adultos);

  - LMC - Leucemia Mielóide Crónica (normalmente surge a partir dos 45 anos);

  - LLA - Leucemia Linfocítica Aguda (mais frequente nas crianças e jovens);

  - LLC - Leucemia Linfocítica Crónica (normalmente surge em adultos com mais de 45 anos).

 

 

Passo agora a explicar, em particular, a LMA (Leucemia Mielóide Aguda):

Este tipo de leucemia desenvolve-se com uma grande rapidez e pode levar à morte de um individuo. Os glóbulos brancos não se desenvolvem como deveriam, e ficam por isso imaturos. Estas células imaturas, a quem se dá o nome de blastos, reproduzem-se, e acumulam-se na medula óssea, e progressivamente destroem as outras células sanguíneas, até que se espalham pela corrente sanguínea, e vão atingindo os vários órgãos enfraquecendo-os.

 

Os investigadores ainda não descobriram a causa que conduz ao desenvolvimento da leucemia. Contudo suspeitam que os vírus, ou factores ambientais estejam envolvidos no desenvolvimento desta doença.

 

Que factores podem contribuir para o aparecimento desta doença? O estilo de vida, e o ambiente em que estão envolvidos, ou até mesmo causas genéticas são factores que podem provocar o aparecimento da leucemia. O tabaco e as radiações solares são agentes mutagénicos propícios à formação de cancro. As altas radiações, e os produtos químicos tóxicos também são factores que levam ao aparecimento da doença. A síndrome de Dawn, a neurofibromatose de Recklinghausen e a anemia de Fanconi aumentam a probabilidade de desenvolver leucemia.

 

A leucemia, sendo um cancro, pode ser proveniente de uma mutação. Mas como? Cada vez que as células se dividem têm de replicar o seu ADN, mas às vezes acontecem erros durante esse processo, contudo podem ser corrigidos por enzimas que têm essa mesma função. Uma vez que os leucócitos, nesta doença, se multiplicam rapidamente, as enzimas não conseguem corrigir todos eles, então surgem as mutações.

 

E ocorre uma mutação onde?

Existem genes que contém a informação para o controlo da divisão celular. Os proto-oncogenes são genes envolvidos na síntese de proteínas que estimulam a divisão celular. Estes genes normalmente estão inactivos em células que não se devem dividir. Mas uma mutação pode levar com que estes genes fiquem activos, criando assim os oncogenes (genes alterados que estimulam permanentemente a divisão celular), e assim se forma um CANCRO. Uns outros genes envolvidos no controlo da divisão celular são os genes supressores tumorais. Estes bloqueiam e controlam a divisão celular, e normalmente estão activos. Se ocorrer uma mutação este gene fica alterado, ficando inactivo, incapaz de bloquear a divisão celular, levando à formação de um CANCRO.

 

Quais os sintomas da leucemia?

Os sintomas iniciais são geralmente fadiga, perda de peso, palidez e infecções. Os primeiros três são sintomas também da anemia. As infecções são derivadas aos leucócitos anormais que portanto não realizam a função de defender o organismo.

 

Como é que a leucemia é diagnosticada?

Através de testes realizados no sangue e na medula óssea: hemogramas, medulogramas e biopsia óssea. Também a procura de anomalias nos autossomas é um método de diagnóstico.

 

Qual o tratamento desta doença?

O tratamento consiste em quimioterapia, tratamento hormonal e por vezes transplante da medula óssea. Após o tratamento é necessário fazer exames de forma regular durante vários anos.

Em suma, a leucemia é uma doença derivada de mutações, até agora é a causa mais plausível que os investigadores descobriram, apesar de ainda haver factos que necessitam de ser justificados. A leucemia enfraquece o organismo, uma vez que as células anormais espalham-se pelo corpo todo através da corrente sanguínea. É uma doença que requer muitos tratamentos. Com a minha investigação consegui esclarecer algumas dúvidas que sempre tive sobre esta doença. A leucemia pode afectar qualquer pessoa, por isso mais vale não arriscar e ter um estilo de vida saudável.

 

Existe uma organização portuguesa contra a leucemia, APCL - Associação Portuguesa Contra a Leucemia. Esta organização fornece apoio financeiro aos doentes e às suas famílias, e ainda apoia a investigação cientifica sobre esta doença. Deixo-vos estes links:

APCL: http://www.apcl.pt

Testemunhos de doentes com leucemia: http://www.apcl.pt/casos-de-vida/testemunhos-de-doentes

Testemunhos de dadores de medula óssea: http://www.apcl.pt/dadores/testemunhos-de-dadores

 

 

Trabalho elaborado a partir da pesquisa:

http://www.roche.pt/sites-tematicos/infocancro/index.cfm/tipos/leucemia/leucemia-diagnostico/

http://www.brasilescola.com/doencas/o-que-e-leucemia.htm

http://mutacoesgeneticas.blogs.sapo.pt/5510.html

http://br.answers.yahoo.com/question/index?qid=20080202163102AAKDEjd

http://ocancro.com.sapo.pt/leucemia.htm

 

Mariana Mesquita